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鎳-瓊脂糖凝膠 H.P. Ni Sepharose H.P.

  • 型   號:生化試劑分離試劑
  • 價   格:
  • 更新時間:2018-07-20
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

產(chǎn) 地:諾博萊德科技
對應(yīng)進口產(chǎn)品:Ni Sepharose High Performance
產(chǎn) 地:國產(chǎn)
性 狀:凝膠狀,保存在20%酒精溶液中
凝膠類型:小配體親和色譜填料
結(jié)構(gòu)成分:6%交聯(lián)瓊脂糖
平均粒徑:34µm
配基基團:Ni2+
配體密度:15μmol/ml
工作PH值:3-12
操作溫度:4-30℃
保存條件:4℃

產(chǎn)品名稱:鎳-瓊脂糖凝膠 HP

產(chǎn)    地:諾博萊德科技

對應(yīng)進口產(chǎn)品:Ni Sepharose High Performance

產(chǎn)    地:國產(chǎn)

    狀:凝膠狀,保存在20%酒精溶液中

凝膠類型:小配體親和色譜填料

結(jié)構(gòu)成分:6%交聯(lián)瓊脂糖

平均粒徑:34µm

配基基團:Ni2+ 

配體密度:15μmol/ml

工作PH值:3-12

操作溫度:4-30

保存條件:4

應(yīng)    用:分離帶His標簽的重組蛋白及能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白,高分辨率。

 

產(chǎn)品說明:

Ni-瓊脂糖凝膠H.P.是用于純化6×His標簽重組蛋白的一種純化介質(zhì),它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的6×His標簽重組蛋白。NTA,含有四個螯合區(qū),較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合,從而使His標簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上,未結(jié)合的蛋白被洗滌下去,結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來,從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標簽蛋白具有*的親和力,可達5-20 mg/mL??稍诜亲冃院妥冃詶l件下純化任何表達系統(tǒng)所得的His標簽蛋白。純化程序簡單,所得的蛋白純度可高達95%。Ni-NTA可再生4-6次,重復使用。本產(chǎn)品懸浮液為20%乙醇,已螯合Ni2+。

操作方法:

A. 非變性條件下抽提His標簽蛋白

1) 準備細胞,接種,誘導表達。收集細胞,置于-70°C或立即進行步驟2操作。

2) 加入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細胞懸浮起來,加入溶菌酶,混勻,冰上放置30分鐘,超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%,充分混勻,冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加至NTA層析柱中,流速在15 mL/h左右,收集穿透部分,用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗,流速控制在30 mL/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫,流速控制在15 mL/h左右,收集洗脫液,每管收集一個NTA體積。

10) 確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,快速確定蛋白質(zhì)的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)純化的目標蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。 NTA-0、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白

1) 準備細胞,接種,誘導表達。收集細胞,置于-70°C或立即進行步驟2操作。

2) 加入1/20細胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細胞懸浮起來,冰上超聲破碎細胞,降低粘稠度。

4) 室溫放置30分鐘,間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉(zhuǎn)/分(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中,流速控制在15 mL/h左右,收集穿透部分,用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗,流速控制在30 mL/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40,GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫,流速在15 mL/ h左右,收集洗脫液,每管收集一個NTA體積。

10) 確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,快速確定蛋白質(zhì)的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11) 目標蛋白質(zhì)需要進一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。 12) 純化的目標蛋白質(zhì)需要復性,復性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生 NTA樹脂在使用若干次數(shù)(3-5次)后,結(jié)合效率有所下降,可以用以下方法再生,提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液,估計出NTA的樹脂體積,按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋?,在等上一步再生溶液流干后,再加下一步再生溶解。用戶需要自行準?5%、50%、75%、100%(v/v)乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。 如果立即使用,用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗;如果想長期儲存,加入1倍體積的20%乙醇,4°C保存,使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗

再生溶液配方:Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

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